MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son un sistema muy importante para la identificación de microorganismos, observar su crecimiento .
se han preparado mas de 10,000 medios diferentes.
Existen medios de cultivos enriquecidos, selectivos y de diferenciación.
estos son algunos medios:
CITRATO DE SIMMONS
El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, un compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el citrato como única fuente de carbono, utilizan sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de Krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso y de transportadores como citrato permeasas.
La citritasa actúa sobre el citrato produciendo ácido oxalacetico y acetato; productos que son convertidos enzimáticamente a piruvato y dióxido de carbono. Durante esta reacción el medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromo timol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.
Técnica
Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estría tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37 grados C por 24 horas.
Interpretación
El desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la formación de productos alcalinos. La prueba también es positiva en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estría de inoculación.
Agar TSI(Triple azúcar hierro)
Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico.
El agar TSI es un medio diferencial que determina tanto la fermentación de los hidratos de carbono y la producción de ácido sulfhídrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, características que son utilizadas para la diferenciación de éstas, principalmente para las Enterobacterias.
Este medio contiene lactosa con una concentración de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observación de la fermentación de uno o de ambos carbohidratos por parte de las bacterias, además de la producción de gas y de ácido sulfhídrico.
La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior). En el pico de flauta la glucosa (monosacárido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaeróbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar ácido pirúvico, y posteriormente éste será degradado a través del ciclo de Krebs para dar CO2, H2O y energía.
Por otra parte la lactosa (disacárido) será primero degradada a sus monosacáridos correspondientes (glucosa y galactosa).
El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentración 10 veces mayor de lactosa. Las Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa están presentes como constituyentes de las bacterias, y éstas pueden obtener mayor energía por utilización del azúcar más simple.
Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar en el ciclo de Embden-Meyerhof. La utilización de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la estría, donde el oxígeno presente actúa como aceptor terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria fermentadora de glucosa ha reducido toda la glucosa disponible a piruvato, comenzará a metabolizar el piruvato a través del ciclo aeróbico de Krebs (sobre la estría), formando productos finales ácidos. El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo inoculado con un fermentador de glucosa tendrán un color amarillo. Si el microorganismo no fermenta la glucosa, el fondo permanecerá rojo (indicando que no hay variación del pH) o se alcalinizará (lo que puede visualizarse por un color rojo algo más intenso que del medio original), demostrando que la bacteria no es miembro de la familia Enterobacteriaceae.
Después de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzará a degradarlas. Como el medio contiene 10 veces más lactosa que glucosa, las bacterias encontrarán sustrato suficiente para continuar la formación de productos finales ácidos. Luego 18 – 24 horas de incubación todo el medio TSI permanecerá de color amarillo. Esta reacción se denomina ácido sobre ácido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La producción de gas provocará la ruptura de la columna de agar o la empujará hacia la parte superior, de modo que un fermentador de lactosa que produce gas dará una reacción A/A más gas.
Interpretación
1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradación aeróbica de glucosa. Amarillo en capa profunda: ácido; degradación anaeróbica de la glucosa.
2. Amarillo en pico: ácido Amarillo en capa profunda: ácido
3. Rojo en pico de flauta: alcalino Sin cambio de color en capa profunda: alcalina.
4. Producción de H2S: precipitado negro
5. Producción de gases: Producción de burbujas, descomposición del medio, ligera muesca del medio sobre el costado del tubo o desplazamiento del medio del fondo, dejando un espacio libre.
E.M.B. Agar
Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
Fórmula (en gramos por litro)
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Instrucciones
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Peptona
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10.0
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Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.
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Lactosa
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5.0
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Sacarosa
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5.0
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Fosfato dipotásico
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2.0
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Agar
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13.5
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Eosina
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0.4
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Azul de metileno
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0.065
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pH final: 7.2 ± 0.2
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SiembraEn superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
IncubaciónDe 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Resultados
Microorganismos
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Tipo de Colonia
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Escherichia coli ATCC 25922
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Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
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Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
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Mucosas, rosa púrpura, confluentes
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Proteus mirabilis ATCC 43071
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Incoloras
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Enterococcus faecalis ATCC 29212
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Incoloras, pequeñas, puntiformes
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Shigella flexneri ATCC 12022
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Incoloras
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Salmonella typhimurium ATCC 14028
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Incoloras
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Características del medio:
Placas preparadas: color púrpura.
Placas preparadas: color púrpura.
La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
Presentación
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x 100g :Código: B02-101-05
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x 500g :Código: B02-101-06
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6 x 50 ml: B04-101-84
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Es un caldo nutritivo y diferencial
Tiene por indicador Rojo de fenol
pH final=6.8 más o menos 0.2
Aquellos que fermentan azucares como la glucosa activan la enzima ureasa
Diferencian organismos como Enterobacteriacea-Proteus-Salmonella y Shigella
Método de preparación
38.7g en 1l de agua
A 108° a 7-10 min
La incubación es en 8hrs.
· Si da negativo a la ureasa tendrán un color durazno
· Si da positivo a la ureasa tendrá un color buganvilia
Limitaciones
Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter viran después de varios días
No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fácilmente.
Si un microorganismo es capaz de hidrolizar la urea pero usa amoníaco como fuente de hidrogeno no produce crecimiento y da un resultado falso positivo.
Características del medio
Medio preparado: Amarillo
Almacenamiento
Medio deshidratado: A 10°-35°C
Medio preparado: 2°-8°C
Resultados
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