Pruebas bioquímicas

Son conjuntos o test usados para detectar alguna propiedad fisiológica o bioquímica de un microorganismo.
Las propiedades bioquímicas son las características más puntuales, evidencian la existencia de enzimas o metabolitos de las vias metabólicas, son la expresión de un gen del ADN.
Enzima: Proteinas altamente especializados encargadas de catalizar reacciones químicas.

Endoenzima: Enzimas intracelulares cuya función es catralizar reacciones tanto de síntesis como de degradación.

Exoenzimas: enzimas extracelular que son secretadas a traves de la pared celular al medio ambiente, para catalizar reacciones de degradación de macromoléculas.

Algunas otras enzimas son hidrolizantes, amilolíticas, que descomponen o hidrolizan los hidratos de carbono en forma de forma parcial o total como en la hidrolisis del almidón.

Fisiología comprende procesos complejos como la fotosíntesis o quimiosíntesis, nutrición, ciclos de transformación de elementos de primordial importancia.

Klieger

Glucosa (+) y no de lactosa, en la superficie el microorganismo oxida la glucosa y al agotarse consume peptonas (alcaliniza el medio)

En el fondo la bacteria fermenta la glucosa produciendo acido y acidifica el medio.

La ruptura del agar en el fondo del tubo indica la producción de gas.

Acido, Acido/Gas

Glucosa (+) y lactosa (+) en la superficie el microorganismo oxida la glucosa y luego la lactosa y por ello se identifica el color amarillo en todo el agar.

En el fondo las bacterias fermentan los azucares, generándose gran cantidad de ácidos y estos difunden en todo el tubo y existe presencia de gas

Alcalino, Acido, Gas, H₂S

La presencia de coloración negra indica que la bacteria ha realizado una respiración anaerobia utilizando tiosulfato con el fin de aceptar electrones. El tiosulfato es transformado en H₂S con el citrato férrico amónico dando lugar a Fe₂S₂ de color negro.

Si la bacteria no fermenta ni glucosa se originan dos resultados.

K/Sin cambio: la bacteria oxida peptonas en la parte inferior del tubo no origina crecimiento.

K/K: Las bacterias consume las peptonas en la parte superior y en el fondo del tubo.

Peptonas: son polipéptidos formados durante la degradación enzimática de proteínas. Son la principal fuente de hidrogeno en el medio orgánico para el cultivo de bacterias. Contienen aminoácidos libres y cadenas cortas de péptidos, ciertas vitaminas y a veces carbohidratos.

Citrato Simmons

 

Si es positivo: El medio se torna azul

Si es negativo; el medio no cambia y mantiene su color verde original

Determinación de catalasa

Agua oxigenada al 30%, se usa para determinar la presencia de catalasa. Esta presente en la mayoría de las bacterias anaerobias y aerobias.

Procedimiento.

Con el asa de siembra tomar una colonia pura de 18-24 hrs de incubación y colocar en portaobjetos.

Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H₂O₂ al 30% sobre la colonia.

Si se forman burbujas se produce O₂ y H₂O por lo que hay catalasa.

                                                                                                                                                             

Mac Conkey

Colonias rojas indica que es positivo a la fermentación de lactosa.

Colonias incoloras que es negativo a la fermentación de lactosa.

TSI

H2S + Fe2(SO4)3S -----> 2FeSO4 + H2SO4

Acido/acido/gas/ No H2S

Alcalino/Alcalino/sin gas/No H2S

Alcalino/Acido/gas/H2S

Alcalino/Acido/ Sin gas/no H2S

A=Reacción acida (color amarillo)

A/A: Fermentación de los tres azucares

K=Alcalina (Color roja/naranja)

K/A: Fermentación de glucosa

K/K=No hay fermentación ni de glucosa, lactosa ni sacarosa

Precipitado negro: H2S

Formación de burbujas: Gas

Elaboración de un antibiograma

 Competencia: Adquirir la habilidad en la preparación de soluciones con antibióticos para la elaboración de un antibiograma.

Material:

o   Papel Filtro

o   Frasco tipo Gerber

o   Antibióticos

o   Solución ionizante/Agua destilada

Antibióticos de amplio espectro
Ampicilina	Vancomicina
Amoxicilina	Cefelosporina
Cloranfenicol	Acido Nalidíxico
Tetraciclina	Ciprofloxacina
Estreptomicina	Rifampicina
Kanamicina	Gentamicina
Azitromicina

Los antibióticos son sustancias capaces de ocasionar enfermedades y eliminar microorganismos causantes de una infección producida por bacterias.

Se le denomina de amplio espectro aquellos que son efectivos frente a un gran grupo de agentes microbianos.

Tienen de efectos:

1.    Inhibición de la síntesis de la pared celular

2.    Alteración sobre la membrana citoplasmática

3.    Inhibición de la síntesis proteica

4.    Bloqueo de síntesis de los ácidos nucleico

Algunas estrategias que tiene una bacteria ante la resistencia de un antibiótico son:

v  Mutación del receptor

v  Modificación del antibiótico

v  Impermeabilidad de la bacteria

v  Expulsión del antibiótico

Hay clasificaciones para el efecto de un antibiótico en una bacteria:

Ø  Sensible. Cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro y que se asocia a una alta probabilidad alta con el éxito terapéutico.

Ø  Intermedio: Cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro y que se asocia a un cierto efecto con el poco éxito terapéutico.

Ø  Resistente: Cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro y que se asocia a una casi nula probabilidad sin ningún éxito terapéutico.

Preapración del antibiograma:

1. Conseguir tabletas de antibioticios, triturarlos con el mortero y pistilo.
2. Con 10 ml de agua destilada, hacer una solución del antibiotico en un vaso cualquiera.
3. Con papel filtro cortado previamente en forma redonda, agregar a la solución y dejar reposar.
4.  Retirar de la solución con ayuda de una pinza y ponerlo en las paredes del frasco gerber.
5. Cuando se use para pruebas bioquímicas, retirar del frasco con ayuda de la pinza y colocarlos con cuidado en el medio, dejando una separación entre ellos. todo despues d ela inoculación.
6. Despues de la incubación, medir los halos que se producieron en el medio, entre mas grandes, significa que el antibiotico es el mas adecuado para combatir a la bacteria.

La Tinción Gram

El frotis o extendido para la tinción de Gram

1.       Con ayuda de él asa de platino, esparcir la muestra en forma circular formando un placa fina


2.       Aplicar 2 gotas de cristal violeta durante 1 min

3.       Aplicar agua destilada en forma indirecta, es decir, inclinar el portaobjetos y agregar el agua poco a poco.

4.       Colocar lugol durante 30 seg.

5.       Lavar de nuevo el frotis

6.       Agregar una gota de alcohol-acetona y escurrir inmediatamente.

7.       Después agregar Safranina.
 
8. Enjuagar con agua , escurrir y secar el frotis y observar en el microscopio primero con el objetivo de 4x. 

Agar TSI(Triple azúcar hierro)

MEDIOS DE CULTIVO

                                                               

 Los medios de cultivo son un sistema muy importante para la identificación de microorganismos, observar su crecimiento .
se han preparado mas de 10,000 medios diferentes.

Existen medios de cultivos enriquecidos, selectivos y de diferenciación.

estos son algunos medios:

CITRATO DE SIMMONS

El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, un compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el citrato como única fuente de carbono, utilizan sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de Krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de  magnesio o manganeso y de transportadores como citrato permeasas.

La citritasa actúa sobre el citrato produciendo ácido oxalacetico y acetato; productos que son convertidos enzimáticamente a piruvato y dióxido de carbono. Durante esta reacción el medio comienza a alcalinizarse por el CO₂ que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromo timol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.

Técnica

Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estría tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37 grados C por 24 horas.

Interpretación

El desarrollo de un color azul intenso  en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la formación de productos alcalinos. La prueba también es positiva en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estría de inoculación.

Agar TSI(Triple azúcar hierro)

Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico.

El agar TSI es un medio diferencial que determina tanto la fermentación de los hidratos de carbono y la producción de ácido sulfhídrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, características que son utilizadas para la diferenciación de éstas, principalmente para las Enterobacterias.

Este medio contiene lactosa con una concentración de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observación de la fermentación de uno o de ambos carbohidratos por parte de las bacterias, además de la producción de gas y de ácido sulfhídrico.

La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior). En el pico de flauta la glucosa (monosacárido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaeróbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar ácido pirúvico, y posteriormente éste será degradado a través del ciclo de Krebs para dar CO₂, H₂O y energía.

Por otra parte la lactosa (disacárido) será primero degradada a sus monosacáridos correspondientes (glucosa y galactosa). 

  

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentración 10 veces mayor de lactosa. Las Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa están presentes como constituyentes de las bacterias, y éstas pueden obtener mayor energía por utilización del azúcar más simple.

Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar en el ciclo de Embden-Meyerhof. La utilización de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la estría, donde el oxígeno presente actúa como aceptor terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria fermentadora de glucosa ha reducido toda la glucosa disponible a piruvato, comenzará a metabolizar el piruvato a través del ciclo aeróbico de Krebs (sobre la estría), formando productos finales ácidos. El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo inoculado con un fermentador de glucosa tendrán un color amarillo. Si el microorganismo no fermenta la glucosa, el fondo permanecerá rojo (indicando que no hay variación del pH) o se alcalinizará (lo que puede visualizarse por un color rojo algo más intenso que del medio original), demostrando que la bacteria no es miembro de la familia Enterobacteriaceae.

Después de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzará a degradarlas. Como el medio contiene 10 veces más lactosa que glucosa, las bacterias encontrarán sustrato suficiente para continuar la formación de productos finales ácidos. Luego 18 – 24 horas de incubación todo el medio TSI permanecerá de color amarillo. Esta reacción se denomina ácido sobre ácido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La producción de gas provocará la ruptura de la columna de agar o la empujará hacia la parte superior, de modo que un fermentador de lactosa que produce gas dará una reacción A/A más gas.

Interpretación

1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradación aeróbica de glucosa. Amarillo en capa   profunda: ácido; degradación anaeróbica de la glucosa.

2. Amarillo en pico: ácido Amarillo en capa profunda: ácido

3. Rojo en pico de flauta: alcalino Sin cambio de color en capa profunda: alcalina.

4. Producción de H₂S: precipitado negro

5. Producción de gases: Producción de burbujas, descomposición del medio, ligera muesca del medio sobre el costado del tubo o desplazamiento del medio del fondo, dejando un espacio libre.

E.M.B. Agar

Fundamento 
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Peptona	10.0	Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.
Lactosa	5.0
Sacarosa	5.0
Fosfato dipotásico	2.0
Agar	13.5
Eosina	0.4
Azul de metileno	0.065
pH final: 7.2 ± 0.2

SiembraEn superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.

IncubaciónDe 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados

Microorganismos	Tipo de Colonia
Escherichia coli ATCC 25922	Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603	Mucosas, rosa púrpura, confluentes
Proteus mirabilis ATCC 43071	Incoloras
Enterococcus faecalis ATCC 29212	Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022	Incoloras
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Incoloras

Características del medio: 
Placas preparadas: color púrpura.

La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.

Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-101-05	x 500g :Código:  B02-101-06	6 x 50 ml: B04-101-84

Caldo de Urea

Es un caldo nutritivo y diferencial

Tiene por indicador Rojo de fenol

pH final=6.8 más o menos 0.2

Aquellos que fermentan azucares como la glucosa activan la enzima ureasa

Diferencian organismos como Enterobacteriacea-Proteus-Salmonella y Shigella

Método de preparación

38.7g en 1l de agua

A 108° a 7-10 min

La incubación es en 8hrs.

·         Si da negativo a la ureasa tendrán un color durazno

·         Si da positivo a la ureasa tendrá un color buganvilia

Limitaciones

Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter viran después de varios días

No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fácilmente.

Si un microorganismo es capaz de hidrolizar la urea pero usa amoníaco como fuente de hidrogeno no produce crecimiento y da un resultado falso positivo.

Características del medio

Medio preparado: Amarillo

Almacenamiento

Medio deshidratado: A 10°-35°C

Medio preparado: 2°-8°C

Mas acerca del Caldo de Urea: https://www.dropbox.com/s/8ks7bd23xxl03z7/291_hoja_tecnica_es.pdf

Resultados